作者：彩楓美國(guó)紅楓基地 發(fā)布時(shí)間：2012年8月2日
本文從加拿大紅楓愈傷組織的誘導(dǎo)開始，探討加拿大紅楓愈傷組織誘導(dǎo)的較適外植體以及較適增殖培養(yǎng)基，為較終建立加拿大紅楓組織培養(yǎng)快速繁殖體系奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 外植體來源
供給試驗(yàn)的材料采自江西科技師范學(xué)院楓林校區(qū)花圃2009年引種栽培的生長(zhǎng)狀況優(yōu)良且無病蟲害的加拿大紅楓，分別取其葉片、葉柄、 帶莖頂芽和側(cè)芽為外植體。
1.1.2儀器與試劑
人工氣候培養(yǎng)箱；垂直流很凈工作臺(tái)；jj500型精密電子天平；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；立式高壓蒸汽滅菌鍋；通風(fēng)廚；Milli-Q很純水系統(tǒng)；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。
1.2 方法
1.2.1培養(yǎng)條件
經(jīng)過初步試驗(yàn)，選用1/2ms培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，添加0.7％瓊脂，３％蔗糖，并調(diào)節(jié) ｐＨ 值至5.8-6.2，然后在121℃下高壓滅菌20min備用；同時(shí)植物生長(zhǎng)激素（1mg/ml）也配好備用；整個(gè)培養(yǎng)過程在以下條件中進(jìn)行：溫度（２５±２）℃，濕度65％，光照14ｈ/ｄ，對(duì)照組光照為24ｈ／ｄ，光照強(qiáng)度1500～2000ｌｘ。
1.2.2 外植體的無菌處理
將所取的外植體經(jīng)初步處理后，在流水下沖洗40min后轉(zhuǎn)入很凈工作臺(tái)中，在紫外燈下滅菌30min，之后在很凈工作臺(tái)中進(jìn)行無菌處理。無菌處理有葉、芽之分：葉片先經(jīng)70％酒精處理10ｓ、12ｓ、15ｓ，然后用無菌水沖洗４～５次，接著用0.1％ HgC12處理3min、5min、7min，再用無菌水沖洗５～６次，較后用２％ NaClO浸泡處理20min后無菌水沖洗５～６次；葉柄、頂芽和側(cè)芽經(jīng)70％酒精處理12ｓ、15ｓ、18ｓ，無菌水沖洗４～５次，接著用0.1％HgC12處理5min、7min、9min，用無菌水沖洗５～６次，較后用２％ NaClo浸泡處理25min，無菌水沖洗５～６次；處理過程中均需用鑷子攪動(dòng)，以達(dá)到充分處理的目的。在無菌條件下，將無菌處理后的葉柄、帶莖頂芽和側(cè)芽切成約１～1.5cm的小段，葉片切成0.5～1cm2大小，其中直接接觸消毒液的切口部位必須切除，并保留芽部分或葉片含有經(jīng)脈部分。將其接種于1/2MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7d后按下列公式統(tǒng)計(jì)外植體的污染率：污染率＝（感菌瓶數(shù)＋燒死或褐化瓶數(shù)）／接種外植體的總瓶數(shù)×100％
1.2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng) 以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，挑選質(zhì)地、大小及生長(zhǎng)狀態(tài)相近的外植體接種于添加了不同濃度的６－芐基嘌呤、萘乙酸及赤霉素等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基配方接種數(shù)為20瓶，每瓶一個(gè)外植體。觀察愈傷組織的誘導(dǎo)率，30d的出愈率：出愈率＝形成愈傷組織的外植體瓶數(shù)／接種外植體的總瓶數(shù)×100％愈傷組織以松脆狀、顏色鮮艷，生長(zhǎng)旺盛為佳。
1.2.4 重復(fù)試驗(yàn)
分別挑選加拿大紅楓健康枝條的葉片、葉柄、帶莖頂芽和側(cè)芽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照1.2.3方法培養(yǎng)，觀察出愈情況。
２ 結(jié)果與分析
２．１ 消毒處理方法
建立無菌培養(yǎng)系是木本植物培養(yǎng)的主要困難之一。外植體的選擇及處理是組織培養(yǎng)中一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)，外植體的生理年齡、發(fā)育階段和外植體取材的部位、健康狀態(tài)等都能夠直接導(dǎo)致外植體誘導(dǎo)愈 傷組織生理狀態(tài)的差異，從而影響組織培養(yǎng)的效果。外源菌與內(nèi)源菌的同時(shí)存在以及滅菌的同時(shí)要保證外植體的生命力的要求給無菌處理加大難度。經(jīng)過多次摸索比較，本實(shí)驗(yàn)決定采用多種消毒液綜合使用的方法對(duì)外植體進(jìn)行無菌處理。結(jié)果見表１。
| 外植體 | 編號(hào) | 消毒處理酒精 | 接種瓶數(shù) | 感菌瓶數(shù) | 燒死或褐化瓶數(shù) | 平均污染率 |
| 葉片 | 1 | 10s20min |
２０ |
１４ |
０ |
７０ |
|
2 |
10s→5min→20min |
２０ |
１１ |
０ |
５５ |
|
|
3 |
10s→7min→20min |
２０ |
８ |
０ |
４０
|
|
|
4 |
12s→3min→20min |
２０ |
７ |
０ |
３５ |
|
|
5 |
12s→5min→20min |
２０ |
４ |
1 |
25 |
|
|
6 |
12s→7min→20min |
20 |
0 |
9 |
45 |
|
|
7 |
15s→3min→20min |
20 |
0 |
11 |
55 |
|
|
8 |
15s→5min→20min |
20 |
0 |
15 |
75 |
|
|
9 |
15s→7min→20min |
20 |
0 |
20 |
100 |
|
|
葉 柄、 頂 芽、 側(cè) 芽
|
10 |
12s→5min→25min |
20 |
14 |
0 |
70 |
|
11 |
12s→7min→25min |
20 |
10 |
0 |
50 |
|
|
12 |
12s→9min→25min |
20 |
10 |
1 |
50 |
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|
13 |
15s→5min→25min |
20 |
6 |
0 |
30 |
|
|
14 |
15s→7min→25min |
20 |
2 |
0 |
10 |
|
|
15 |
15s→9min→25min |
20 |
1 |
3 |
20 |
|
|
16 |
18S→5min→25min |
20 |
0 |
13 |
65 |
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17 |
18S→7min→25min |
20 |
0 |
16 |
80 |
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18 |
18S→9min→25min |
20 |
0 |
20 |
100 |
試驗(yàn)結(jié)果表明：70％酒精、0.1％ HgCl2、２％ NaCLO的結(jié)合使用，比任何消毒液?jiǎn)为?dú)或兩種結(jié)合使用的效果都好，且保持了外植體相對(duì)較強(qiáng)的生活力。由表１數(shù)據(jù)可以看出，不同的處理時(shí)間，外植體的污 染率也有所不同，隨著時(shí)間的增加污染率降低，且有葉芽之分。葉片以５號(hào)處理，而葉柄、頂芽和側(cè)芽則以１４號(hào)處理得到的污染率較低，分別為25％、10％。若消毒液處理時(shí)間再增加則開始出現(xiàn)褐化及燒死現(xiàn)象，不利于培養(yǎng)。
2.2 光照對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響
將加拿大紅楓葉片、葉柄、頂芽和側(cè)芽分別接種于12種不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)基中，進(jìn)行14h/d及24h/d光照培養(yǎng)。觀察出愈時(shí)間和愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)。其結(jié)果見表２。
由表２可以分析出２種條件下誘導(dǎo)出的愈傷組織的生長(zhǎng)速度及狀態(tài)的差異：24h/d光照培養(yǎng)的8d后有愈傷組織長(zhǎng)出，其后生長(zhǎng)的愈傷組織表面有一定的濕度，有光澤，質(zhì)地疏松，顏色也較鮮艷；14h/d光照培養(yǎng)的11ｄ后開始有愈傷組織，其后生長(zhǎng)的愈傷組織大部分都較干，致密而且顏色較深不鮮艷。30ｄ后統(tǒng)計(jì)出愈率以及對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)的分析結(jié)果皆表明全光照培養(yǎng)更適合愈傷組織的誘導(dǎo)。
2.3溫度和濕度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響
本實(shí)驗(yàn)所采用的培養(yǎng)溫度為25℃，濕度為65％，有利于外植體愈傷組織的誘導(dǎo)。與艾麗皎等的研究報(bào)道相一致。
2.4植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響
以加拿大紅楓的葉片、葉柄、頂芽、側(cè)芽為材料，通過前實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或單獨(dú)使用細(xì)胞分裂素（6-BA）、生長(zhǎng)素（NAA）的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織需要很過25ｄ，而且愈傷組織生長(zhǎng)很其緩慢，所以本實(shí)驗(yàn)選擇加入一定濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康模邕m量的加入赤霉素（GA3）有助于打破細(xì)胞休眠促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)通過將不同配比的細(xì)胞分裂素（6-BA）與生長(zhǎng)素（NAA）添加于不同編號(hào)的1/2Ms培養(yǎng)基中，８ｄ后可誘導(dǎo)出愈傷組織，30d后計(jì)算出愈率，結(jié)果見表３。
注：植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度單位為ｍｇ／Ｌ。 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度配比的確定是組織培養(yǎng)中一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。通過將經(jīng)無菌處理的外植體接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)植物激素6-BA 和NAA濃度對(duì)外植體出愈率的影響有著顯著差異。由表３可以看出，隨著6-BA濃度的增加，出愈率出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在6-BA含量低的培養(yǎng)基上，愈傷組織產(chǎn)生的時(shí)間晚且速度慢；而在6-BA 含量相同的條件下，發(fā)現(xiàn)NAA含量低對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)有促進(jìn)的作用,如果含量過高卻只能起到抑制愈傷組織生長(zhǎng)的作 用。本實(shí)驗(yàn)綜合出愈時(shí)間、出愈率、愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)，得出：頂芽和側(cè)芽的相對(duì)較適培養(yǎng)基配方是４號(hào)；葉片的相對(duì)較適培養(yǎng)基配方是１號(hào)；葉柄的相對(duì)較適培養(yǎng)基配方是７號(hào)。
３ 小結(jié)與討論
適當(dāng)?shù)闹参锷L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度配比，不僅可以保證較高的出愈率，還可保證一定的出芽率及芽苗的生長(zhǎng)質(zhì)量。在初代培養(yǎng)中，既能產(chǎn)生愈傷組織，又有不定芽的分化，顯著縮短了的組培快繁周期，并且 可以有效地減少伴隨愈傷組織培養(yǎng)代數(shù)增加而產(chǎn)生變異的可能性，以保持組培品種的優(yōu)良種性，這在組織培養(yǎng)中具有很為重要的意義。關(guān)于木本植物誘導(dǎo)愈傷組織的報(bào)道目前本就不多，而關(guān)于加拿大紅楓組織培養(yǎng)的報(bào)道資料就更加有限。所以，探索加拿大紅楓較適外植體和消毒方法來降低污染率、死亡率，以及尋求較佳的組培快繁技術(shù)途徑是非常值得研究的。試驗(yàn)表明，加拿大紅楓不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組 織長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)差異明顯，頂芽及側(cè)芽誘導(dǎo)出的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)較好，顏色鮮艷且不會(huì)呈現(xiàn)干巴的狀態(tài)。在以1/2MS的培養(yǎng)基上，配合使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，均能誘導(dǎo)出愈傷組織，尤其是頂芽，在1/2MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA0.1ｍｇ/L＋GA30.1ｍｇ/L培養(yǎng)基中，接種８ｄ后就有愈傷組織產(chǎn)生，且出愈率高，愈傷組織狀態(tài)優(yōu)良。葉片誘導(dǎo)出的愈傷組織，狀態(tài)相對(duì)來說有些不良，顏色為暗紅色，表面較干，而且葉片無菌處理難度較大；葉柄誘導(dǎo)愈傷組織能力較差，對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度變化敏感，不適宜被選作外植體。這為該屬植物的組織培養(yǎng)技術(shù)的建立提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。然而，對(duì)于利用加拿大紅楓不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行再分化產(chǎn)生叢生芽，從而進(jìn)行快速繁殖獲得新植株，以及建立加拿大紅楓組織培養(yǎng)快速繁殖的技術(shù)體系，還有待于進(jìn)一步深入研究。