作者：彩楓美國紅楓基地 發布時間：2012年8月4日
美國紅楓是槭樹屬植物,近幾年來， 槭樹屬植物的繁殖技術特別是快繁技術逐漸受到重視, 目前國內外對槭樹科植物的組培快繁技術研究較少, 僅有茶條槭、元寶槭和挪威楓等少數幾種建立了較為完善的組織培養體系。作為槭樹屬植物中較流行的彩色綠化植物之一的美國紅楓, 其繁殖技術的研究還多停留在播種、扦插等傳統育苗方式上, 而有關組培快繁方面的研究報道較為少見。現通過美國紅楓組織培養過程中外植體選擇及滅菌、啟動培養和褐化抑制等技術的探討研究, 為以后美國紅楓組織培養技術的進一步研究提供了依據。
1 材料與方法
1. 1 材料試驗材料取自生長健壯的美國紅楓母株, 由北京林業大學良種繁育研究中心提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 外植體的消毒
分別取木質化莖段、半木質化莖段、室內水培芽、當年實生苗作為外植體,選用70% 乙醇、0. 1% 升汞、1% 次氯酸鈉3 種消毒劑。將試驗材料剪切成1. 5~ 2. 0 cm 帶腋芽莖段( 尖) , 用毛刷蘸肥皂水刷洗3~ 5 min, 流水沖洗30 min, 轉移至很凈工作臺。在無菌條件下,用70% 的乙醇消毒30 s, 再分別用不同的消毒劑處理, 較后用無菌水沖洗3~ 5 次, 切去傷口部分,接種到啟動培養基上。每個處理接種30 個外植體, 重復3 次, 15 d 后統計外植體污染率、褐化死亡率、存活率及觀察生長狀況, 并按公式計算相關參數:
污染率/% = 污染個數/ 接種個數@ 100
褐化死亡率/%= 褐化死亡個數/ 接種個數@ 100
存活率/% = ( 接種個數- 污染個數- 褐化死亡個數) / 接種個數@ 100
1. 2. 2 褐化抑制
將經過消毒處理的外植體按5 種處理方式進行分析外植體的褐化現象, 每個處理接種30 個外植體, 重復3 次, 10 d 后比較各處理方式對褐化的抑制效果, 并按以下公式計算相關參數:
褐化率/% = 褐化個數/ 接種個數@ 100
處理方式:
Ñ. 對照( CK) ;
Ò. 添加活性炭( AC) 1 g#L-1 ;
Ó. 添加硝酸銀( AgN O3 ) 10 mg#L-1 ;
Ô. 添加聚乙烯吡咯烷酮( PVP) 1 g#L-1 ;
Õ. 接種初期每兩天將外植體轉移至新鮮培養基中, 重復2~ 3 次。
1. 2. 3 外植體的啟動培養
將經過消毒處理的外植體接種含有不同濃度6-BA、NAA 的MS 培養基中培養, 每個處理接種30 個外植體, 重復3次, 30 d 后觀測莖段抽芽數量, 并按公式計算相關參數:
抽芽率/% = 抽出新芽并達到21 0 cm 以上的外植體個數/ 接種個數@ 100
2 結果與分析
2. 1 外植體的選擇
2. 1. 1 外植體種類對其成活率的影響
將4 種外植體均用1%次氯酸鈉消毒5 min, 從表1 中數據可以看出, 以當年實生苗為外植體進行培養時, 其污染率和褐化率較低, 分別為7. 78% 和5. 55%, 成活率較高為86. 67% , 其次是室內水培芽和半木質化莖段, 效果較差的是木質化莖段。
2. 1. 2 外植體種類對腋芽生長的影響
取未污染的外植體各25 個繼續培養, 30 d 后統計抽芽個數計算抽芽率, 并觀察抽芽時間以及芽苗的生長情況。由表2 可以看出, 不同外植體其腋芽抽芽時間和抽芽率有較大差別, 半木質化莖段和木質化莖段所需的抽芽時間較短, 為5~ 7 d, 抽芽率分別為84. 00% 和80. 00% ; 室內水培芽抽芽需要的時間為10~ 15 d, 抽芽率為72. 00% , 而當年實生苗抽芽需要15 d 以上, 抽芽率為28. 00% 。從腋芽的生長情況來看, 木質化莖段、半木質化莖段以及室內水培芽的新生腋芽都生長健壯; 而當年實生苗腋芽生長細弱。綜合各因素考慮, 選擇半木質化莖段作為美國紅楓組織培養的外植體較為合適。
2. 2 外植體表面滅菌
選擇不同的消毒劑( 70% 乙醇、0. 1% 升汞、1%次氯酸鈉) 和不同處理時間( 2、4、8、15 min) 對半木質化莖段進行表面消毒, 從表3 中結果可以看出, 隨著消毒時間的增加, 外植體的污染率總體趨勢都在逐漸下降, 而褐化率卻隨著消毒時間的增加而上升, 從單因素角度來看, 75%乙醇的消毒效果較差, 0. 1%升汞雖然消毒效果較好但是褐化嚴重, 導致較終成活率較低, 1% 次氯酸鈉的作用界于二者之間, 在消毒4 min 時成活率較高為82. 22%消毒處理不僅影響外植體的表面消毒效果,而且對隨后外植體的腋芽生長也有較大影響。從表3 中可以看出, 3 種消毒劑的作用都是隨著消毒時間的增加而抽芽率下降, 經過長時間75% 乙醇消毒后新芽長勢細弱, 葉片顏色黃綠; 經過短時間的0. 1% 升汞消毒后新芽能夠正常生長, 但長時間的消毒處理會導致腋芽不易抽芽, 且抽出的新芽生長畸形; 而用1% 次氯酸鈉消毒處理后抽出的新芽葉片顏色深綠, 長勢健壯。因此, 從提高外植體的成活率同時又盡量降低消毒劑對外植體傷害的角度考慮, 采用1% 次氯酸鈉溶液消毒4 min 為較佳消毒方式。
2. 3 褐化
在對美國紅楓莖段培養時發現, 外植體普遍存在褐化現象。為此, 選用5 種不同的處理方式對美國紅楓外植體褐化現象的抑制作用進行比較研究, 結果表( 見表4) , 處理Õ的褐化率為0, 褐斑直徑為0, 能有效的抑制外植體褐化。
表4 不同處理方式對控制外植體褐化的影響
處理 褐化率% 平均褐斑直徑/cm
Ⅰ 44.44 1.73
Ⅱ 15.56 -
Ⅲ 21．11 0.82
Ⅳ 17.78 0.65
Ⅴ 0 0
2. 4 啟動培養基的篩選
將經過消毒處理的外植體接種到培養基上培養, 發現植物激素6-BA 和NAA 濃度對外植體抽芽率的影響有著顯著的區別, 隨著6-BA 和NAA濃度的增加, 腋芽的抽芽率都表現出先升高后降低的趨勢, 在6-BA含量低的培養基上生長的腋芽抽枝較慢, 生長也較慢, 節間不展開, 隨著濃度的增加愈傷組織生長旺盛, 外植體漸漸枯死,在6-BA含量相同的條件下NAA 在很低含量的時候就能促進腋芽的抽芽和生長, 而過高的濃度反而會導致愈傷組織的大量生長。數據經過反正弦轉換后進行2 因素4 水平的方差分析( 見表6,表7, 表8) , 結果表明, 6-BA 和NAA 各水平間的差異以及二者交互效應均很顯著, 在分別對6-BA和NAA 進行SSR 檢驗和Duncan 新復很差比較后發現, 當6-BA 濃度在1. 0 mg#L-1 , 而NAA 濃度在0. 1~ 0. 2 mg#L-1 時外植的抽芽效果較好,而NAA 濃度在0. 1~ 0. 2 mg#L-1 對外植體的抽芽作用無明顯差異, 因此, 啟動培養基為: MS+ 6-BA1. 0 mg#L-1+ NAA0. 1 mg#L-1。
表7 6-BA濃度對外植體抽芽率影響的多重比較
6-BA/mg.L-1 抽芽率/%
1.0 53.33aA
2.0 39.07bB
0 2 0.47cC
3.0 16.91cC
表8 NAA濃度對外植體抽芽率影響的多重比較
NAA/mg.L-1 抽芽率/%
0.2 43.37aA
0.1 43.07 aA
0 23.26bB
0.3 20.59bB
3 結論與討論
外植體的選擇是組織培養中一個非常重要的問題。外植體的生理年齡、發育階段和外植體取材部位不同都可導致外植體生理生化狀態差異,從而影響組織培養的效果。研究結果表明, 不同來源的外植體對污染率的影響較大, 以當年實生苗為外植體時其污染率和褐化率低、成活率較高,半木質化莖段和室內水培芽次之, 而木質化莖段由于長期暴露在空氣中, 其表面帶菌較多, 容易產生污染現象, 而且木質化莖段含有的次生代謝物較多, 褐化也較嚴重。此外, 不同外植體對隨后腋芽生長也有較大的影響。試驗結果表明, 半木質化莖段和木質化莖段接種后都容易抽芽, 芽苗生長也較為健壯; 室內水培芽可能由于體內積累的營養物質含量有限而抽芽時間相對緩慢; 當年實生苗抽芽速度較慢, 且芽苗生長細弱。綜合試驗結果是選擇半木質化莖段作為美國紅楓組織培養的外植體。
木本植物組織培養中的困難之一是建立無菌培養體系, 因此為了保證組織培養成功, 在外植體接種前必須進行消毒。試驗結果表明, 選用半木質化莖段作為外植體, 經過70% 乙醇和0. 1%升汞的長時間處理后對外植體腋芽的生長產生了較大的影響, 這可能是因為長時間的處理使消毒劑侵入到了材料組織細胞內, 影響了材料的正常生長; 而1% 次氯酸鈉消毒后腋芽生長正常, 原因可能是由于次氯酸鈉分解性強, 對材料的傷害小。所以研究中外植體在無菌條件下先用70% 的乙醇浸潤30 s, 然后用1% 次氯酸鈉溶液消毒4 min, 能取得較好的消毒效果。在許多植物組織培養過程中, 減輕和控制外植體褐化問題是一項非常重要的研究內容。組織培養過程中產生褐化的因素多為多酚氧化酶( PPO) 和總酚含量等物質的存在, 在培養基中添加適量的抗氧化劑和吸附劑等可以有效的抑制或減輕褐化現象。在美國紅楓培養過程中也普遍存在外植體的褐化現象, 對培養基分別添加Vc、A C、PVP 以及通過不斷轉換新鮮培養基的處理方法都能不同程度的抑制褐化, 通過比較發現在外植體培養初期每2 d 將外植體轉移至新鮮培養基中, 2~ 3 次后即可以較徹底地去除褐化現象, 且對后續的培養沒有影響。以美國紅楓半木質化莖段為外植體, 在MS+6-BA 1. 0 mg#L-1+ NAA 0. 1 mg#L-1 培養基上進行啟動培養, 抽芽率高, 芽苗生長正常。這表明,適當的生長調節劑種類和濃度既可以保證較高的抽芽率, 又可以保證芽苗的生長質量。關于進一步的美國紅楓增殖培養和生根培養正在進行研究。