作者：彩楓美國紅楓基地 發(fā)布時(shí)間：2012年8月5日
目前為止，日本紅楓主要以成熟胚、頂端分生組織作為日本紅楓培養(yǎng)的外植體來源, 但取材受到嚴(yán)格的生長季節(jié)限制。而以莖節(jié)及葉片作為外植體的愈傷誘導(dǎo)分化成功率比較低，因此本試驗(yàn)以日本紅楓品種的嫩莖和新生葉片為外植體材料，在生長素IAA與細(xì)胞分裂素6-BA不同濃度組合和MS與WPM不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下，對(duì)其進(jìn)行外植體愈傷組織誘導(dǎo)增殖和分化的研究。
外植體：采集日本紅楓新生枝條上葉片及嫩莖（含莖節(jié)）。
1、 外植體的獲得
選取帶側(cè)枝的幼嫩莖段，切取接近莖節(jié)的嫩莖及靠近葉柄部位的葉片，洗滌液浸洗20min，流水沖洗1 ～ 2h，70％的酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，然后置于0.1%HgCl2溶液中滅菌4min，無菌水沖洗5次，獲得無菌材料待用。
2、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)
嫩莖切成5mm莖段，葉片切成5mm×5mm大小葉塊，無菌操作臺(tái)上接種于MS培養(yǎng)基，激素水平選擇為6-BA（0.2、0.4、0.8mg/L）、IAA（0.1、0.2mg/L），25℃下暗處理2d后，1 500±50μmol（photon）/m2•s光強(qiáng)下培養(yǎng)10d（12h/d），觀察記錄愈傷組織誘導(dǎo)情況。
3、 愈傷組織增殖培養(yǎng)
確定合適的外植體及愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)以MS與WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在愈傷組織誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，添加的激素水平為6-BA（0.6、0.8mg/L）、IAA（0.1、0.2mg/L），20d后觀察記錄愈傷組織的增殖情況。
4、 愈傷組織分化培養(yǎng)
將增殖獲得的愈傷組織切成1cm3大小的組織塊，分別接種于分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽的分化。分化培養(yǎng)以1/2MS和WPM為基本培養(yǎng)基，分別添加激素6-BA（0.8、1.4、2.0mg/L）、IAA（0.1、0.2mg/L）。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)8個(gè)處理組合，每個(gè)處理組合接種20塊，觀察并記錄芽的分化以及生長狀況，選擇適宜的分化培養(yǎng)基。
1、 愈傷組織誘導(dǎo)率分析 嫩莖段在接種5d內(nèi)，所有培養(yǎng)基組合中均不同程度地在莖段切口處開始膨大，并發(fā)生黃綠色愈傷組織，其中IAA（0.2mg/L）+6-BA（0.8mg/L）組合誘導(dǎo)率較高，而葉片均未發(fā)現(xiàn)變化，出現(xiàn)個(gè)別皺縮枯死，可能是部分消毒時(shí)脫水嚴(yán)重導(dǎo)致。由表1可知，接種10d后，在葉片周緣也開始出現(xiàn)黃白色愈傷組織，數(shù)量明顯低于莖段，表明葉片難于誘導(dǎo)愈傷組織，或誘導(dǎo)效率沒有嫩莖高。
2、 愈傷組織誘導(dǎo)染菌率分析
由于實(shí)驗(yàn)接種數(shù)量的有限，所以就外植體對(duì)染菌率的影響沒有很強(qiáng)的代表性，記錄對(duì)比得出嫩莖和葉片在誘導(dǎo)愈傷組織中的差異，葉片誘導(dǎo)愈傷組織的染菌率高于嫩莖段，較可能的原因是葉片表面積大，不容易對(duì)葉片徹底消毒，其次鑒于采集月份已過初生葉片時(shí)期，帶菌率會(huì)增高。一定程度上能說明采用嫩莖作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織更有效。
將初代誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于不同繼代增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)14d后觀察增殖生長情況，結(jié)果見表2。培養(yǎng)基中6-BA/IAA比例較高時(shí)（1、2、5、6號(hào)），愈傷組織表面有顆粒狀突起，顏色偏深，但形態(tài)結(jié)構(gòu)致密，生長緩慢，甚至部分停止生長。當(dāng)6-BA與IAA濃度相對(duì)接近時(shí)，愈傷組織增殖生長旺盛，形態(tài)結(jié)構(gòu)松散，在WPM培養(yǎng)基上也會(huì)發(fā)生顆粒突起結(jié)構(gòu)，且增殖率普遍高于使用MS培養(yǎng)基。7號(hào)培養(yǎng)基（WPM+IAA0.2mg/L+6-BA0.6mg/L）上愈傷組織相對(duì)增殖率較高，效果較好。
經(jīng)增殖培養(yǎng)獲得大量的愈傷組織，分瓶轉(zhuǎn)移至設(shè)計(jì)好的不同分化培養(yǎng)基，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)分化，經(jīng)過20d培養(yǎng)后觀察分析。由表3可知，除1號(hào)和7號(hào)培養(yǎng)基上愈傷組織出現(xiàn)褐變外，大多數(shù)分化培養(yǎng)基上愈傷組織開始變得致密，顏色變深，部分愈傷組織中有紅色芽原基出現(xiàn)。但隨著6-BA/IAA濃度比例增加，只在3、5、6號(hào)培養(yǎng)基中有少數(shù)不定芽的分化，其中WPM+IAA0.1+6-BA2.0培養(yǎng)基上的出芽率稍高，長勢(shì)相對(duì)較好。高濃度的6-BA可能利于愈傷組織不定芽分化，而選用的1/2MS與WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基也未在分化誘導(dǎo)上表現(xiàn)出明顯差異。后隨著愈傷組織的體積增加以及培養(yǎng)時(shí)間的延長，出現(xiàn)大量老化現(xiàn)象，較終沒有出現(xiàn)明顯的叢生芽。
外植體的建立是離體快繁的基礎(chǔ)，選擇合適的外植體對(duì)植物組培的離體快繁十分重要，不同種類的外植體對(duì)離體培養(yǎng)的反應(yīng)是不同的，培養(yǎng)效果也不同。本次外植體采集時(shí)間為4月中旬，氣候濕潤轉(zhuǎn)暖，葉片生長中帶菌率相對(duì)較高，且葉片相對(duì)面積大不利于滅菌，因此葉片的染菌率明顯高于嫩莖。而日本紅楓愈傷組織誘導(dǎo)再生體系的探究中，采用幼嫩莖節(jié)和葉片理論上都是合適的外植體材料，但由于葉片愈傷組織誘導(dǎo)啟動(dòng)期較長，而實(shí)驗(yàn)中葉片染菌率較高，影響了其后期愈傷組織的誘導(dǎo)可能。實(shí)驗(yàn)依據(jù)日本紅楓為木本植物選用了MS、1/2MS和WPM三種基礎(chǔ)培養(yǎng)基。結(jié)果得知WPM培養(yǎng)基下紅楓愈傷組織增殖良好。但只有配合使用適當(dāng)?shù)闹参锛に夭拍苷T導(dǎo)細(xì)胞的分化，培養(yǎng)物的形態(tài)建成、不定芽再生。采用激素是IAA和6-BA，培養(yǎng)基中加入的少量生長素促進(jìn)細(xì)胞分裂，在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)愈傷組織的形成有明顯的促進(jìn)作用。加入不同的細(xì)胞分裂素以促使愈傷組織分化出不定芽。6-BA作為一種常用的細(xì)胞分裂素，它在促進(jìn)紅楓腋芽發(fā)育的啟動(dòng)、芽的增殖中有顯著作用，由于實(shí)驗(yàn)以愈傷組織器官發(fā)生方式進(jìn)行，因此6-BA未得到十分顯著的效果，可嘗試更高的濃度或探索其他的細(xì)胞分裂素，以求通過日本紅楓非腋芽外植體啟動(dòng)愈傷組織誘導(dǎo)再生體系的研究。