作者：彩楓美國紅楓基地 發布時間：2012年8月5日
目前為止，日本紅楓主要以成熟胚、頂端分生組織作為日本紅楓培養的外植體來源, 但取材受到嚴格的生長季節限制。而以莖節及葉片作為外植體的愈傷誘導分化成功率比較低，因此本試驗以日本紅楓品種的嫩莖和新生葉片為外植體材料，在生長素IAA與細胞分裂素6-BA不同濃度組合和MS與WPM不同基礎培養基條件下，對其進行外植體愈傷組織誘導增殖和分化的研究。
外植體：采集日本紅楓新生枝條上葉片及嫩莖（含莖節）。
1、 外植體的獲得
選取帶側枝的幼嫩莖段，切取接近莖節的嫩莖及靠近葉柄部位的葉片，洗滌液浸洗20min，流水沖洗1 ～ 2h，70％的酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次，然后置于0.1%HgCl2溶液中滅菌4min，無菌水沖洗5次，獲得無菌材料待用。
2、愈傷組織誘導培養
嫩莖切成5mm莖段，葉片切成5mm×5mm大小葉塊，無菌操作臺上接種于MS培養基，激素水平選擇為6-BA（0.2、0.4、0.8mg/L）、IAA（0.1、0.2mg/L），25℃下暗處理2d后，1 500±50μmol（photon）/m2•s光強下培養10d（12h/d），觀察記錄愈傷組織誘導情況。
3、 愈傷組織增殖培養
確定合適的外植體及愈傷組織誘導培養基后，將愈傷組織轉入繼代增殖培養基，繼代培養以MS與WPM為基礎培養基，在愈傷組織誘導的基礎上，添加的激素水平為6-BA（0.6、0.8mg/L）、IAA（0.1、0.2mg/L），20d后觀察記錄愈傷組織的增殖情況。
4、 愈傷組織分化培養
將增殖獲得的愈傷組織切成1cm3大小的組織塊，分別接種于分化培養基中誘導芽的分化。分化培養以1/2MS和WPM為基本培養基，分別添加激素6-BA（0.8、1.4、2.0mg/L）、IAA（0.1、0.2mg/L）。正交試驗設計8個處理組合，每個處理組合接種20塊，觀察并記錄芽的分化以及生長狀況，選擇適宜的分化培養基。
1、 愈傷組織誘導率分析 嫩莖段在接種5d內，所有培養基組合中均不同程度地在莖段切口處開始膨大，并發生黃綠色愈傷組織，其中IAA（0.2mg/L）+6-BA（0.8mg/L）組合誘導率較高，而葉片均未發現變化，出現個別皺縮枯死，可能是部分消毒時脫水嚴重導致。由表1可知，接種10d后，在葉片周緣也開始出現黃白色愈傷組織，數量明顯低于莖段，表明葉片難于誘導愈傷組織，或誘導效率沒有嫩莖高。
2、 愈傷組織誘導染菌率分析
由于實驗接種數量的有限，所以就外植體對染菌率的影響沒有很強的代表性，記錄對比得出嫩莖和葉片在誘導愈傷組織中的差異，葉片誘導愈傷組織的染菌率高于嫩莖段，較可能的原因是葉片表面積大，不容易對葉片徹底消毒，其次鑒于采集月份已過初生葉片時期，帶菌率會增高。一定程度上能說明采用嫩莖作為外植體誘導愈傷組織更有效。
將初代誘導出的愈傷組織接種于不同繼代增殖培養基上，培養14d后觀察增殖生長情況，結果見表2。培養基中6-BA/IAA比例較高時（1、2、5、6號），愈傷組織表面有顆粒狀突起，顏色偏深，但形態結構致密，生長緩慢，甚至部分停止生長。當6-BA與IAA濃度相對接近時，愈傷組織增殖生長旺盛，形態結構松散，在WPM培養基上也會發生顆粒突起結構，且增殖率普遍高于使用MS培養基。7號培養基（WPM+IAA0.2mg/L+6-BA0.6mg/L）上愈傷組織相對增殖率較高，效果較好。
經增殖培養獲得大量的愈傷組織，分瓶轉移至設計好的不同分化培養基，對其進行誘導分化，經過20d培養后觀察分析。由表3可知，除1號和7號培養基上愈傷組織出現褐變外，大多數分化培養基上愈傷組織開始變得致密，顏色變深，部分愈傷組織中有紅色芽原基出現。但隨著6-BA/IAA濃度比例增加，只在3、5、6號培養基中有少數不定芽的分化，其中WPM+IAA0.1+6-BA2.0培養基上的出芽率稍高，長勢相對較好。高濃度的6-BA可能利于愈傷組織不定芽分化，而選用的1/2MS與WPM基礎培養基也未在分化誘導上表現出明顯差異。后隨著愈傷組織的體積增加以及培養時間的延長，出現大量老化現象，較終沒有出現明顯的叢生芽。
外植體的建立是離體快繁的基礎，選擇合適的外植體對植物組培的離體快繁十分重要，不同種類的外植體對離體培養的反應是不同的，培養效果也不同。本次外植體采集時間為4月中旬，氣候濕潤轉暖，葉片生長中帶菌率相對較高，且葉片相對面積大不利于滅菌，因此葉片的染菌率明顯高于嫩莖。而日本紅楓愈傷組織誘導再生體系的探究中，采用幼嫩莖節和葉片理論上都是合適的外植體材料，但由于葉片愈傷組織誘導啟動期較長，而實驗中葉片染菌率較高，影響了其后期愈傷組織的誘導可能。實驗依據日本紅楓為木本植物選用了MS、1/2MS和WPM三種基礎培養基。結果得知WPM培養基下紅楓愈傷組織增殖良好。但只有配合使用適當的植物激素才能誘導細胞的分化，培養物的形態建成、不定芽再生。采用激素是IAA和6-BA，培養基中加入的少量生長素促進細胞分裂，在一定濃度范圍內對愈傷組織的形成有明顯的促進作用。加入不同的細胞分裂素以促使愈傷組織分化出不定芽。6-BA作為一種常用的細胞分裂素，它在促進紅楓腋芽發育的啟動、芽的增殖中有顯著作用，由于實驗以愈傷組織器官發生方式進行，因此6-BA未得到十分顯著的效果，可嘗試更高的濃度或探索其他的細胞分裂素，以求通過日本紅楓非腋芽外植體啟動愈傷組織誘導再生體系的研究。